Determinación de la resolución estructural experimental e in-silico de proteínas : 1) determinaciones por microscopía electrónica 2) determinaciones por cristalografía de Rayos X 3) ensayos in silico

Detalle STAN:

Este servicio ofrece la resolución estructural experimental de proteínas mediante Microscopía Electrónica y Cristalografía de Rayos X, e in-silico mediante programas de Inteligencia Artificial y Machine Learning. Se realizan estudios para incrementar el conocimiento científico y para asesorar en el desarrollo de productos biotecnológicos. Destinatarios: instituciones públicas y privadas.

Prestación Detalle:

1) se preparan grillas por tinción negativa y/o cryo-EM, se toman las micrografías y se procesan hasta la obtención de un mapa con un modelo atómico 2) se hacen ensayos iniciales de cristalización con su posterior optimización, se toman los datos de difracción de los cristales y se procesan hasta la obtención de un mapa con un modelo atómico 3) las secuencias de las proteínas se someten a programas y servidores de Inteligencia Artificial y Machine Learning para predecir los modelos atómicos.

Metodología:

1) Las muestras son provista por el contratante. 2) Se realiza el ensayo o la determinación correspondiente: 2.1) Para Microscopía Electrónica 3-4 ul de muestra se montan en grillas de cobre/rodio o cobre/paladio recubiertas de una capa fina de carbono. Para tinción negativa, las grillas son contrastadas con acetato de uranilo al 2% (p/v). Para condiciones criogénicas (cryo-EM) las muestras son montadas sobre las grillas con un equipo Vitrobot (FEI-Thermo Scientific) o Leica EM-GP (LEICA Microsystems) modificando los tiempos de “blotting” y vitrificadas en etano líquido. La toma de datos de tinción negativa se realiza mediante un microscopio JEM-1400Flash (JEOL). La toma de datos de cryo-EM se realiza en los microscopios del Brazilian Nanotechnology National Laboratory (LNNano) y de diversas instituciones europeas mediante propuestas científicas. 2.2) Para Cristalografía, se hacen ensayos iniciales de cristalización con robots de cristalización y kits comerciales a través del método de difusión de vapor en gota sentada variando la relación proteína/precipitante. Aquellas condiciones que rinden cristales son optimizadas ajustando las variables iniciales (concentración y naturaleza de reactivos, pH, temperatura de incubación, etc). Para los complejos proteína-ligando, se utilizan las técnicas de co-cristalización en presencia del ligando, y/o soaking de los compuestos en cristales de la apoproteína. Los cristales son difractados en un difractómetro de rayos X D8 QUEST (Bruker AXS) o en sincrotrones como DESY (Alemania), SOLEIL (Francia) y SIRIUS (Brasil). El procesamiento de los datos es ejecutado en computadoras de alto rendimiento. 2.3) Para los ensayos in-silico, las secuencias de las proteínas objetivo se someten a una serie de programas y servidores de Inteligencia Artificial y Machine Learning con el fin de obtener sus respectivas estructuras 3D. 3)Se entrega un informe final que no remite carácter de certificación.

Equipamiento:

Difractómetro de rayos X Bruker D8 QUEST Eco dotado de fuente de rayos X Bruker D8 QUEST ECO | Microscopio Electrónico de transmisión (TEM) Jeol 1400 Flash

Disciplina Primaria:

Bioquímica y Biología Molecular

Disciplina Desagregada:

BIOLOGIA-BIOQUIMICA

Campo de Aplicación:

Salud humana

Actividad Industrial:

Investigación y desarrollo experimental en el campo de las ciencias exactas y naturales n.c.p. | Cultivos temporales

Palabras Clave:

Proteína
Estructura
Función
Cristalografía de rayos X
Microscopia electrónica

Responsable: OTERO, Lisandro Horacio

Contacto: lhotero@exa.unrc.edu.ar